各类细胞培养小结

2012-02-17 00:00 来源:丁香通 作者:
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大鼠皮层神经元原代培养

液体配制:

硼酸硼砂缓冲液:0.05M四硼化钠45ml,0.2M硼酸55ml,pH8.4;

胰酶-EDTA消化液:胰酶-0.125g;EDTA-0.2g;D-Hanks平衡盐液定容至100ml

所用的培养板、培养瓶或玻片预先经100μg/L多聚赖氨酸硼酸盐缓冲液于37℃包被4h,三蒸水洗三遍晾干备用。

操作步骤如下:

1. 孕16d SD大鼠经戊巴比妥钠麻醉后,碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤,依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜,无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks平衡盐液中。

2.在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层,除去脑膜,剪碎组织成约1mm3大小,加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min,中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM+10%FBS)的离心管内终止消化液作用5min。

4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM+10%FBS的离心管内,用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次,静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2~3次。

5. 将所收集的上清经200目筛网过滤。

6.过滤后的细胞悬液于800r/min离心5min,弃上清,管内加入新鲜培养液(DMEM+20%FBS)并吹打成单细胞悬液。

7. 细胞计数,调整细胞密度按1.5×105/cm2种入6孔板内,放入CO2孵箱中培养。培养48h后换液并加入Ara-C使其终浓度为1×10-5mM/L。Ara-C作用24h后全量换液。以后每隔3天半量换液一次。

『注意以下几点』

1.上面的步骤是传统方法。有许多地方可以进行改动:如消化时可以直接用0.125-0.25的胰酶消化15-20min左右,也可用DNA酶进行消化,有人还直接进行吹打,都可行。

2.上面虽然时大鼠皮层神经元,但是同样适用于小鼠,但是应该选择 孕13d 左右的小鼠。

3.神经元是一种比较难培养的细胞,因此在接种时细胞的密度一定要够!!

4.在玻片上培养神经元时,一定要注意玻片的来源和处理方法,这个非常重要,对神经细胞的影响是很大的。如果您现在在玻片上培养的神经元生长情况还不错的话,那么您在以后的培养中最好还是用同一来源(厂家)的玻片。

5.如果有B27和neurobasal培养基,那么就方便了(不用加AraC)--

1)把细胞悬液用(DMEM+20%FBS)悬浮,种到培养皿上6-12h后,全量换成2%B27的neurobasal培养基,继续培养,3d半量换液。

2)把细胞悬液用直接用2%B27的neurobasal培养基悬浮接种。

3)可以用新生1d内的胎鼠皮层直接培养。

胶质细胞培养(astrocyte, oligodendrocyte)

取材及胶质细胞的混合培养

1.P2 SD大鼠经低温麻醉后以碘酒和75%乙醇消毒,无菌操作下,断头放入预冷的D-Hanks液中,在解剖显微镜下取大脑皮层并除去脑膜。

2. 剪碎组织成1mm3大小,加入胰酶-EDTA消化液并放入37℃孵箱内消化20min,中间摇晃一次。

3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的MEM+10%FBS(Glial Medium,GM)的离心管内终止消化液作用5min。

4.吸出组织转移到另一支装有冷的GM的离心管内,用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次,静置后取上清并吸到另一支离心管内。重复上述步骤2~3次。

5.所得上清于800r/min离心5min,弃上清,管内加入新鲜GM并吹打成单细胞悬液。细胞计数,调整细胞密度按1.5×105/cm2种入25cm2培养瓶,放入孵箱培养。以后每隔2~3d进行全量换液。

摇床振摇分离星形胶质细胞和寡突胶质细胞

培养至7~10天,换液后放入孵箱继续培养24h,取出拧紧培养瓶盖,于37℃恒温摇床上280r/min摇动18h。此时寡突胶质细胞90%以上在培养悬液内而与瓶底贴壁的星形胶质细胞分离。

分离培养悬液内的寡突胶质细胞

吸出悬液至离心管内950r/min离心10min,弃上清后管内加入新鲜GM,吹打成单细胞悬液,按1.5×105/cm2种入预先用100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。24h后换成DF12+N2的无血清培养液,此后每三天半量换液1次。

瓶底星形胶质细胞的继续培养

25cm2培养瓶内的星形胶质细胞用D-Hanks液洗2次后常规传代,以1.5×105/cm2种入预先用100μg/L多聚赖氨酸包被好的35mm培养皿培养。培养液为GM,每三天半量换液1次。

动脉粥样硬化患者VSMC的提取

实验材料:眼科剪刀1把 眼科镊子2把 1×PBS约200ml M199培养液 离心机 5ml小皿 10ml大皿

实验步骤:

1.在超净台内用10ml的离心管分装5ml的1×PBS(已高压灭菌)。

2.手术台上取患者发生动脉粥样硬化改变的病变动脉,分放入准备好的PBS中,拿回实验室在超净台中,无菌条件下剥去外膜,用手术刀片刮去内膜,留下中膜并将其剪成1×1mm大小组织块。

3.消化法:PBS清洗组织块后并将其转移入10ml的离心管,加入0.125%胰酶消化37℃30分钟,室温吹打100分钟或者振荡器振荡100分钟,待组织块变小且消化液变粘时,收集消化液配平以1500转/分钟离心10分钟后,收集细胞种植于预先加入M199培养液的5ml小皿中放入37度5%CO2的培养箱中。

4.贴块法:PBS清洗组织块后移入已准备好的10ml大皿中,块间距为0.5cm,放入37度5%CO2的培养箱中,3小时后,待组织块贴壁后,再加入2ml培养液后放回37度5%CO2的培养箱中。注意:最后加入2ml培养液时应使其顺无组织块的皿边缘缓慢流下,勿使组织块吹下。

5.随后每3天予以半量换液。

6.一周后可见组织块周围有细胞爬出,大约3周后80%融合。因本人系非细胞生物学专业人员,本细胞培养时间又很短,多次进行细胞传代未成功,还望有经验的专家指点。

膀胱平滑肌细胞细胞原代培养

1.麻醉后消毒,下腹正中切口于膀胱颈(结扎处远端约1~2cm)

2.严格无菌操作取出标本、手术台位于超净台旁

3.在超净台,40u/ml庆大霉素溶液中浸泡5分钟

4.生理盐水漂洗1次

5.D-hanks液漂洗1次

6.放入D-hanks液中,除去粘膜、粘膜下及浆膜

如果是Shame组兔,以10ml注射器抽取约8ml D-hanks液,于粘膜层下注射起泡后,剪去粘膜层,直接剪取平滑肌组织,弃浆膜层及其上未剪下之肌组织。

new: 如果是不全BOO兔,则可将膀胱剪成宽约0.5cm之条状,撕去粘膜层后,助手以一眼科镊将该组织一端固定,眼科镊与该组织垂直,并夹持整个横截面,术者同法夹持于附近,助手持第3把眼科镊提起肌组织,术者以手术刀锐性分离肌层;如此,向另一端推进,锐性分离肌条。

7.在超净台,取相当于0.5为X0.5 CM2肌块,室温下将其剪碎成1~2mm碎组织块

8.转移入离心管

9.加入D-hanks液(操作成功) OR Dulbecco

10.离心1000转/min,10分钟 离心半径13cm,弃上清

11.加入I型胶原酶(2mg/ml) 5mg,(II型胶原酶2mg/ml 5mg也可,但效果不如I型胶原酶)

12.不要加入DMEM为主要成分的培养液(否则胰蛋白酶失活)

13.转移入培养瓶中

14.4度下过夜孵育。

15.加0.25%胰蛋白酶

16.36.5度振荡消化15~30min,弃上清。(可省)

17.200目(74um)不锈钢网过滤。(可省)

18.转移入离心管,吹打后待可见物沉淀,吸尽沉淀(避免组织块培养法)

19.离心1000转/min,10分钟 离心半径13cm,弃上清

20.加培养液至10ml(ok)

21.转移入培养瓶中

22.CO2恒温箱中培养

23.12h后收集未贴壁细胞并计数 

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