各类细胞培养小结

2012-02-17 00:00 来源:丁香通 作者:
字体大小
- | +

脾脏单个核细胞悬液的制备

(1) 大鼠断颈处死后,无菌取脾置于消毒平皿中称重

(2) 超净工作台上置10cm直径无菌平皿,加入5~10ml D-hanks平衡液 ,置一80目的不锈钢筛于平皿中,脾脏置于筛网中,用剪刀剪碎脾,用5ml玻璃注射器针芯轻轻捻磨脾脏,使分散的细胞滤过金属网进入平皿的液体中, D-hanks冲洗一次;

(3) 用吸管吸取冲洗液,200目的钢筛过滤一次后收集至离心管中;

(4) 1000rpm,离心5~10min,弃上清;

(5) 加入约1ml双蒸水,吸管打匀后20s后加入等量的1.8%的NaCl溶液,然后加入大量D-hanks调节渗透平衡,以红细胞,但对白细胞没有影响;

用D-hanks液洗涤细胞2~3次,用含有1mM/L的谷氨酸胺、100IU/ml青霉素G、100μg/ml链霉素、10%的胎牛血清的RPMI-1640重悬细胞,调节细胞浓度为5×106/ml,台盼兰染色检测细胞存活率大于95%;

(7) 接种至培养板或培养瓶中。

猪肺泡巨噬细胞的培养

1、细胞培养所用溶液及其配制

1×RPMI1640及:按照产品说明配制,过滤除菌,4℃保存备用。

新生牛血清:56℃灭活30min,-20℃保存备用。

2×104U/ml青、链霉素液(双抗):青链霉素各2×106 U溶于100ml灭菌双蒸水中,过滤除菌,分装,-20℃保存备用。

10×Na2EDTA-胰酶溶液(2.5%):Na2EDTA 0.2g,NaCl 8.0g,KCl 0.2g ,Na2HPO4-12H2O 2.89g,KH2PO4 0.2g,1%酚红溶液1.5ml,胰酶(1:250)2.5g,溶于100ml双蒸水中,NaOH调节pH至7.2~7.5,过滤除菌,分装,-20℃保存备用,使用时1∶10倍稀释。

7.5%NaHCO3: 7.5g NaHCO3溶于100ml双蒸水中,115℃高压灭菌15min,置4℃冰箱冷藏备用。

10% RPMI1640营养液:于1×RPMI1640溶液中加入10%小牛血清,按照1% 比例加入2×104U/ml双抗,用0.5% NaHCO3或10% HCl溶液调节pH值至7.2~7.4。

2、将50日龄的SPF仔猪放血,结扎气管后无菌摘取其肺脏,先用0.9%的生理盐水洗涤外表面,将pH7.2的PBS30.0ml从气管灌入肺脏,轻轻拍打肺表面,1~2min后回收灌洗液,如此反复进行,直至灌洗液清亮为止。将回收的支气管肺泡灌洗液用吸管轻轻吹打,将细胞团块打散,用单层无菌100目不锈钢筛过滤,收集全部灌洗液,2000r/min离心10min,收集沉淀。洗涤两次后加入适量含10%胎牛血清的1×RPMI1640营养液吹散细胞,置培养瓶或培养皿中于37度CO2培养箱中培养,待其贴壁后弃去上清及非黏附细胞继续用含10%胎牛血清的1×RPMI1640培养液培养备用。

神经细胞培养

一.设备: 无菌操作设备。

二.大型设备CO2培养箱:恒温5%、10%CO2维持培养液中pH值。

倒置显微镜:用于每天观察贴壁细胞生长情况。

解剖显微镜,用于准确地取材。

常温冰箱:-4℃,用于保存各种培养液,解剖液和鼠尾胶。

低温冰箱:-20℃--80℃,用于储存血清酶,贵重物品和试剂。

电热干烤箱:用于消毒玻璃器皿。高压消毒锅:用于消毒培养皿,手术器械。

过滤器:配制解剖液、培养液,必须过滤后才可使用,以去除细菌。

渗透压仪,pH剂,天平等。

三.培养器皿及手术器械

1.培养皿:常用35mm塑料及玻璃皿,解剖取材用15mm-90mm直径。

2.培养板,24-40孔,可用于开放培养。

3.培养瓶;

4.吸管,常用1,5,10ml,均需泡酸、洗涤、灭菌后方可使用。

5.各类培养液贮存器。

6.小型手术器械。

准备:

一.配制培养液

(1)解剖液:以无机盐(去除Ca2+, Mg2+ )加葡萄糖配制成PBS缓冲液,保持一定的渗透压和pH值。

(2)基础培养基(MEM):主要为多种氨基酸,加入葡萄糖,双蒸馏水溶解。

(3)接种培养液:用于胰酶消化后的细胞分散,做成细胞悬液,其成分为MEM含1%谷氨酰胺,另加入10%马血清,当天配制。

(4)维持培养液:接种后24h,全部换成此液,后每2周换一次,每次换1/2。其成分为MEM中含5%马血清,1%谷氨酰胺,及适量的支持性营养物质。

二.培养基质 常用鼠尾胶、小牛皮胶,多聚赖氨酸,再涂胶

三.消毒培养皿的备用。所有培养器皿均需清水冲洗2-3d,达两次ddH2O,每遍洗刷3-4次,加塞包装,置于烤箱中干燥消毒,于培养前1天进行。

神经细胞分散培养

(一)选材 常用胚胎动物或新生鼠神经组织。鸡胚常用胚龄6-8d,新生鼠或胎鼠(12-14d)或人胚胎。不过也有认为与组织相关。如大白鼠胚胎以19d为宜,小鼠以18d为宜,大鼠纹状体以10d为宜;若纹状体与黑质联合培养的大鼠胚,则黑质以13d,纹状体18-21d为宜;小脑以20-21d小鼠胚胎,所获蒲氏细胞成活率高,颗粒细胞正在分化;脊髓与DRG联合培养,常用4-7d鸡胚或12-14d小鼠胚胎,取材易,神经成活率高。

(二)取材。脑则取出相应组织,在解剖液中先剪碎,以使胰酶消化。脊髓则固定于琼脂板上,用小刀将其要成背腹两侧,分别培养。

(三)细胞分离与接种。神经组织用0.125-0.25%胰蛋白酶在37℃孵育30min,移入接种液,停止消化,并洗去胰蛋白酶液,用细口吸管吹打细胞悬液,使其充分分散,如此多次,待沉淀后吸出上层细胞悬液,计数,预置细胞密度,接种于培养皿(1×106),做电生理应为5×105或更低。

(四)抑制胶质细胞生长。培养3-5d后,也有人认为培养7d后,用阿糖胞苷,或5-FU抑制神经胶质细胞的生长。

大鼠心室肌微血管内皮细胞的原代培养

材料和方法

1.仪器:

手术器械一套,倒置显微镜(Leica),CO2细胞孵育箱(Heraeus),超净工作台(苏州净化设备有限公司),扫描电子显微镜(Hitachi)。

2.主要试剂

DMEM高糖培养基(Gibco),胎牛血清(Hyclone,杭州四季青生物工程材料公司),胰蛋白酶、EDTA(Ameresco);小鼠抗人CD105单克隆抗体(NeoMarkers),兔抗人CD34、CD31多克隆抗体(Antibody Diagnostica Inc),兔抗人vW因子多克隆抗体(华美公司),抗兔及抗鼠ABC试剂盒、DAB显色试剂盒为华美公司产品,其他试剂均为国产分析纯以上级别。

3.方法

3.1 植块法原代细胞培养[1]:

细胞培养瓶的处理[2]:选用50ml玻璃培养瓶,高压蒸汽灭菌,瓶底铺自制鼠尾胶(制作方法参见2),移入80℃烤箱烤干,临用前用消毒D-Hanks平衡盐缓冲液冲洗3次。

选用80克SD大鼠(雌雄不限,购自复旦大学实验动物部),1%戊巴比妥钠(1ml/100g)腹腔注射麻醉,75%酒精浸泡5min消毒,将大鼠移至超净台进行操作,止血钳固定四肢,逐层打开胸腔,暴露心脏,剪开心包,由升主动脉处剪下心脏,放入D-Hanks平衡盐缓冲液中,冲净心腔中的血液,辨清心脏解剖结构,去除大血管、左右心房以及右心室和室间隔,保留左心室,小心去除心内膜及心外膜,用眼科剪剪碎余下的心室肌约2mm见方,滴加1ml进口胎牛血清,均匀接种于处理过的50ml培养瓶中,放入37℃、5%CO2、饱和湿度的细胞孵育箱静置培养,使其贴壁,4小时后追加20%胎牛血清的DMEM高糖培养液4.5ml/瓶,约48小时后组织块周围有星形细胞长出,80至96小时组织块周围有大量细胞长出,去除组织块,继续培养36-48小时,待细胞汇合铺满瓶底后用含0.125%胰蛋白酶、0.02%EDTA的消化液消化细胞进行传代,取用第二代细胞进行进一步鉴定和实验。

(五)观察。接种6-12h,开始贴壁,并有集合现象,细胞生长突起明显,5-7d胶质细胞增生明显,7-10d胶质细胞成片于神经细胞下面,形成地毯,2周时神经细胞生长最丰满,四周晕光明显,一个月后,有些神经细胞开始退化,变形,甚至出现空泡,一般培养2-4周最宜。

但神经细胞只能增大,而不能增殖,只能原代,不能传代,不会有细胞周期,而且随培养时间的延长,细胞数量在下降,但胶质细胞可以,神经胶质细胞也可以。在培养过程中,早期9-12d时,有较多的神经细胞死亡,这是第一次死亡阶段,应注意保持条件的恒定。在此之后存活下去的细胞一般突起长而多,且相互形成突触。

分页: [ 1 ]   [ 2 ]   [ 3 ]   [ 4 ]   [ 5 ]   [ 6 ]   [ 7 ]   [ 8 ]  

编辑: 陈

版权声明

本网站所有注明“来源:丁香园”的文字、图片和音视频资料,版权均属于丁香园所有,非经授权,任何媒体、网站或个人不得转载,授权转载时须注明“来源:丁香园”。本网所有转载文章系出于传递更多信息之目的,且明确注明来源和作者,不希望被转载的媒体或个人可与我们联系,我们将立即进行删除处理。同时转载内容不代表本站立场。