软骨细胞培养
软骨细胞的原代培养
龄新西兰乳兔(雌雄不限，共18只，分6次处理),溺死，置于75%酒精溶液中10分钟，拿入超净工作台，自眼外眦至耳屏前剪开皮肤暴露皮下组织，再次严格消毒，自外眦外将颧弓由根部剪断，暴露髁状突，去净髁状突表面软组织及软骨膜，以眼科剪剪取髁状突表面的透明软骨，以磷酸缓冲液（PBS含青霉素、链霉素各100U/L）冲洗2遍，将软骨剪切成1－3mm3 左右碎块，0.25%胰蛋白酶先消化30-35分钟，PBS浸洗2遍；后置于50ml玻璃培养瓶，加0.1%Ⅱ型胶原酶(DMEM配制)，37消化3.5－4.5小时，每小时置37℃恒温振荡箱振荡5min。直到软骨块大部分呈肉眼可见的絮状物，倒置显微镜下观察，软骨细胞大部分分离后，以弯头吸管轻轻吹打，细胞悬液以1200r/min离心7分钟，弃上清，以含10％新生牛血清DMEM的培养液终止消化，离心弃上清以洗去细胞表面的酶，悬浮细胞并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90％。将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温，5%CO2 浓度，饱和湿度培养箱内培养。2天后换液1次，以后隔天更换培养液，倒置显微镜观察、照相记录细胞形态及贴壁生长情况。待细胞贴壁达到85%－90%后传代。
软骨细胞的传代培养
待细胞贴满壁后传代。传代时，吸干培养液，用PBS液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25%胰蛋白酶－0.01%EDTA（1比1）消化液，以覆满瓶底为限，置温箱2～3 min 后，显微镜下观察到细胞质已回缩，细胞间隙增大，即向培养皿里滴入2 mL 左右含血清的培养液终止消化，收集第1代培养细胞，用弯头吸管吸取混和液，反复多次轻吹皿底细胞，使细胞彻底从培养瓶底壁脱落，收集细胞混和液，1200r/min离心7分钟，弃上清，以含10％新生牛血清的DMEM清洗细胞3次，制成细胞悬液，将细胞以2×105/ml接种于25cm2培养瓶内，置于37 ℃恒温，5%CO2 浓度,饱和湿度培养箱内培养。隔天更换DMEM培养液。以第3代软骨细胞制成细胞悬液并计数，台盼蓝染色检测细胞活力为90%，调整细胞浓度为5×107/ml，用于实验。
传代 吸干培养液，用PBS 液轻洗细胞2次，培养皿内加入0.25 %的胰蛋白酶，以覆满皿底为限,置温箱2～3 min 后，显微镜下观察到细胞质已回缩,细胞间隙增大，少部分细胞已浮于消化液中，用吸管吸取混和液，反复多次轻吹皿底细胞，使细胞彻底从培养皿底壁脱落，收集细胞混和液，离心，用PBS 液漂洗2 次，再制成细胞悬液，计数，检查细胞活力，按每个培养皿接种2 ×105 个细胞再培养。
兔膀胱平滑肌细胞的分离、培养和鉴定
一、摘要 目的：建立兔膀胱平滑肌细胞的分离、培养和鉴定的方法。方法：成年新西兰白兔两只（正常及梗阻各一只），采用酶法分离技术获得膀胱平滑肌细胞后于10%小牛血清的DMEM中培养，观察细胞形态和扩增情况，用爬片染色、电镜、蛋白质α-肌动蛋白（α-actin）鉴定细胞类型。结果：倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构、细胞爬片HE染色及电镜检查均证实为平滑肌细胞。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。结论：该方法易行、可靠、在短期内可获得大量高纯度膀胱平滑肌细胞。
二、 材料及方法
1、 试剂及标本
成年同龄雄性新西兰白兔2只，体重约2.5~3k(购于南京军区南京总医院动物实验中心)，一只为正常成年雄性新西兰白兔，一只为膀胱出口不全梗阻8周成年雄性新西兰白兔。DMEM、Ⅱ型胶原酶及α-肌动蛋白抗体（α-actin）购于北京华美公司；胎牛血清购于杭州四季青公司；胰蛋白酶购于南京生兴公司。
2、 膀胱平滑肌细胞酶法分离
肌注盐酸氯胺酮200mg及氟哌利多5mg麻醉，待兔进入麻醉状态后消毒，下腹正中切口，迅速切取膀胱组织。超净台内依次庆大霉素溶液（浓度为100单位/毫升）、生理盐水及D-Hanks液中浸泡洗涤5分钟，然后放入D-Hanks液中除去黏膜、黏膜下及浆膜层。肌肉剪成肉糜后0.1%胶原酶（Ⅱ型2mg/ml）溶液40过夜消化（约10-12小时）。然后加0.25%胰蛋白酶37℃消化30分钟，消化液变混浊呈絮状提示消化良好。用100目细胞筛过滤该絮状液，混悬液离心（1000转/分，离心半径13cm）5分钟，沉淀的细胞移入培养皿，加入含10%胎牛血清的DMEM，置于50ml/L CO2 、37度饱和湿度孵育箱中静置培养，培养液每周更换2-3次。
3、 传代培养
待培养的细胞通过增殖达到约80%汇合状态时做传代处理。弃去原培养瓶中的旧培养液，加入适量的PBS(因培养液中的胎牛血清对胰蛋白酶有抑制作用)，轻轻摇动，清洗残留的培养液后弃之。加入适量的消化液，使其覆盖整个细胞，将培养瓶放置于CO2培养箱，不时在倒置显微镜下观察，当细胞胞质回缩，胞间间隙增大后，吸出消化液，并向培养瓶中加入含10%胎牛血清的培养液终止消化。用吸管吸取培养瓶中的培养液，反复吹打瓶壁制备细胞悬液，吹打时不能用力过猛，尽量不出现气泡，以免损伤细胞。细胞进行计数后，按照1X105~106密度将细胞接种于培养瓶中。
4、 培养细胞的观察及鉴定
采用倒置显微镜观察平滑肌细胞的形态及生长情况。细胞爬片HE染色观察细胞形态。电镜检查。免疫组化染色检测α-actin。
结果
两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔7天左右、而梗阻兔则需10~12天可于50毫升培养瓶约80%汇合。均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培养瓶约80%汇合。本组中均传至第8代，经第8次传代后，平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构（图1 对照组2周的细胞；图2 实验组培养2周的细胞）。细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型(见图3)。电镜检查可见平滑肌细胞密班结构（图4分离后培养细胞的电镜检查发现平滑肌细胞致密班结构）。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应（图5）。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%。
三、 讨论
平滑肌细胞的培养方法可分为两类：组织块法和酶消化法。组织块法适用于细嫩、易碎的组织；其方法较简单；但容易产生杂质如成纤维细胞等，成纤维细胞生长快，故培养之细胞质量较差；培养的大多数细胞无收缩性；且原代细胞的获得需3~4周，获得大量平滑肌细胞耗时长（17）。既往酶消化法较组织块法复杂、精细；适宜的酶浓度和培养时间的确定较为困难；然而在较短时间内可获得大量的平滑肌细胞，1996年有学者报道（Chambers（18）等）酶消化法纯度为70%。可见一种快速、高效、高纯度的酶消化法培养膀胱平滑肌的方法显得尤为重要。
本实验研究两只兔所有标本均获成功。倒置显微镜观察平滑肌细胞24小时均可见膀胱平滑肌细胞贴壁生长，正常兔7天左右、而梗阻兔则需10~12天可于50毫升培养瓶约80%汇合。均传代顺利，传代后约正常兔6天左右、而梗阻兔需8~9天可于50毫升培养瓶约80%汇合。本组中均传至第8代，经第8次传代后，平滑肌细胞仍生长迅速，未见衰老迹象。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构。细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型。电镜检查可见平滑肌细胞密班结构。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应。从细胞爬片HE染色和免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应中我们发现该方法所的膀胱平滑肌细胞的纯度几乎99%（在以下的膀胱平滑肌细胞的共聚焦检测中也证实了这一点）。 膀胱平滑肌的鉴定（10）主要根据其细胞形态及α-actin的检测。倒置显微镜下观察均呈“谷和峰”样结构；细胞爬片HE染色见膀胱平滑肌细胞细胞核呈两端钝圆的卵圆形平滑肌细胞核型；电镜检查可见平滑肌细胞密班结构，这些细胞形态学的检测均证实其为膀胱平滑肌细胞。免疫组化染色检测α-actin呈阳性反应更进一步证实了该方法所获得的细胞为膀胱平滑肌细胞。已有学者通过实验发现：酶消化法获得的膀胱平滑肌细胞细胞膜通道的密度有所下降；细胞膜电位和细胞膜电阻稍微降低。他们认为通过酶消化法所获得的膀胱平滑肌细胞经培养、传代后仍基本保持着原有的电生理特性，由此在体外研究的结果可较好的反映体内情况（21）（20）。梗阻后的膀胱平滑肌细胞在生长扩增中明显较正常膀胱平滑肌细胞时间长，也说明了这种酶消化法对膀胱平滑肌细胞的影响不是太大，还是保留着体内的基本特性。在我们的激光扫描共聚焦显微镜的检测中平滑肌细胞内的钙离子荧光强度在M受体激动剂的影响下发生明显变化，这更进一步证实了该方法分离培养出的膀胱平滑肌仍保持着收缩功能。
从实验研究中我们体会到该方法：1、简便、易行、易掌握及短期内可获大量高质单个膀胱平滑肌细胞；2、应严格无菌操作；3、仔细彻底剥除膀胱黏膜、黏膜下及浆膜层，是确保获的大量高质单个膀胱平滑肌细胞的基础；4、膀胱平滑肌组织应尽量减碎以确保充分消化；5、严格控制胶原酶和胰蛋白酶的浓度和消化时间，见消化液混浊、组织块呈絮状，或在倒置显微镜下见消化液中有较多单个细胞或细胞小团块时即终止消化；6、细胞筛的运用也是获得高质单个膀胱平滑肌细胞的基础。
1. Chamley CJ,Campbell GR,Ross R.The smooth muscle cells in culture.Physiol Rev 1979 59（1）:1-61.
2. Chambers P,Neal DE,Gillespie JI.Ca2+ signalling in cultured smooth muscle cells from human bladder .1996 Exp Physiol 81 (4):553-564.
3．Korkmaz M, Guvenc BH, Bilir A et al. Isolation and culture of adult and fetal rabbit bladder smooth muscle cells and
their interaction with biopolymers.J Pediatr Surg. 2003 Jan;38(1):21-24.
4.Sui GP, Wu C, Fry CH .A description of Ca2+ channels in human detrusor smooth muscle. BJU Int. 2003 Sep;92(4):476-478.
5. Sui GP, Wu C, Fry CH. The electrophysiological properties of cultured and freshly isolated detrusor smooth muscle cells.J Urol. 2001 Feb;165(2):627-632.
SD大鼠VSMC的原代培养(贴块法)
实验材料：手术剪1把、手术钳2把、眼科剪刀2把 、眼科镊子1把 、大头针4个、手术刀片、无菌1×PBS约500ml 20%FBS的DMEM、5ml小皿3个、 10ml大皿1个、杀鼠板1块。（以上均为无菌物品）
实验步骤
1、 150-200gSD-大鼠，短头，浸入75%的酒精中15min
2、 置入超净台中，将大鼠固定于杀鼠板上，在无菌条件下打开腹腔，分离出胸主、腹主，摘出。
3、 PBS清洗3遍，剥去外膜，用手术刀片刮去内膜，留下中膜并将其移入1ml的培基中、剪成1×1mm大小组织块。
4、再将PBS清洗组织块，移入25ml的培养瓶中，用尖嘴弯管均匀贴好组织块，放入37度5％CO2的培养箱倒置培养6小时后，待组织块贴壁后，再加入2.5ml培养液后放回37度5％CO2的培养箱中。注意：最后加入2ml培养液时应使其顺无组织块的皿边缘缓慢流下，勿使组织块吹下。
5、 随后每3天予以全量换液。
6、 3-5天后可见组织块周围有细胞爬出，大约2周后80％融合。
本人曾做过3个月的SD大鼠VSMC的原代培养，基本上的所有的障碍都遇到过，现在已做的相当成功，并乐意与大家分享经验！
