骨髓基质细胞的原代
材料方法
1. 材料：
1.1材料来源：取自健康成人行骨髓内固定术扩髓前收集骨髓腔内骨髓。
1.2主要试剂：DMEM培养基、胎牛血清（FBS）、β-甘油磷酸钠（β-GP）、维生素C、青链霉素 、胰蛋白酶（1:250）-EDTA
1.3主要仪器设备 双人超净台 Farma Scientific美国 、单人超净台 Farma Scientific美国、二氧化碳孵箱、Farma Scientific美国、低温冰箱 Farma Scientific美国、倒置相差显微镜 Nikon 日本、细胞培养皿35Ф Corning 美国、6孔、96孔培养板 Corning 美国
2. 方法
2.1原代细胞培养：于髓内钉内固定术扩髓前，用肝素化后的注射器抽取3-5ml骨髓，置入预装有DMEM培养液的无菌50ml离心管带至实验室。1000rpm离心10分钟弃上层脂肪，取沉淀细胞加入适量DMEM， 22G针头吹打成单细胞悬液，细胞计数后按所需浓度接种于培养瓶或培养板，加入完全培养液（含青链霉素各100u/ml,体积分数10%的胎牛血清、β-GP 10mmol/L、维生素C 50ng/ml、高糖DMEM）置于37℃，含体积分数5%的CO2 湿化空气孵箱中培养，3天后半量换液，以后隔日全量换液，倒置相差显微镜每日观察细胞生化情况。
2.2传代培养：原代培养至7-8天，细胞接近80%融合倒出培养液，1×PBS清洗两遍，用0.25%胰蛋白酶加0.02%EDTA消化细胞2分钟，镜下观察至细胞分离脱壁后，立即加入完全培养液终止消化，细胞刮刀刮除细胞，将瓶内液体吸入离心管，1000rpm离心10分钟，弃上清，加入完全培养液将细胞重悬，并混合均匀计数后接种于培养皿，行传代培养。
胚胎小鼠纹状体神经干细胞的分离培养及鉴定
①原代细胞的培养：取孕13.5天昆明种二级孕小鼠，引臼脱颈处死,碘酒、乙醇消毒腹部，逐层剖开腹部皮肤、肌肉、腹膜，取出子宫，放入盛有D1-SGH液的器皿中。仔细剥离胎膜、羊膜，暴露胎鼠，剪开颅骨，取出胎鼠脑组织并转移至另一盛有D1-SGH液的器皿中，体视显微镜下剥离脑膜，分离胎鼠纹状体，仔细剥离血管及脑膜，将收集到的纹状体在D-hanks液中漂洗两次，置于盛有4℃D-hanks液的器皿中，用虹膜剪将组织剪碎，加入0.125℅的胰酶消化(37℃，15min)，期间每隔5min震荡一次。500转离心5min，弃上清，D-hanks液清洗两次，将沉淀细胞重悬于增殖培养基中，培养基成分：DMEM/F12（1：1），2% B27 supplement，青霉素、链霉素各100U/ml，EGF 20 ng/mL，b-FGF 10ng/mL。用火焰抛光的吸管反复吹打，分散组织制成单细胞悬液，吸取9滴细胞悬液、1滴0.4℅台盼蓝溶液混合，用血细胞计数板在3分钟内计数出活细胞和死细胞（台盼蓝排斥法），调整细胞密度，以105个/ mL接种75mL培养瓶中（NUNC），于5℅CO2 培养箱，37℃培养。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。
②传代培养：当神经球直径大约100um时收集细胞于离心管中，600转离心5分钟，弃上清，加入无血清培养基重悬细胞，吸管轻轻吹打细胞，使之形成单细胞悬液，计数后以104个/ mL接种75mL培养瓶中，于5℅CO2培养箱， 37℃培养，完成一次传代。此后每隔两天半量换液，5-7天机械分离细胞传代1次。期间倒置显微镜下观察细胞的生长状况。
兔晶状体上皮细胞培养方法和体会：
1、原代培养：健康成年白家兔空气栓塞处死，立即取出眼球，1∶1000庆大霉素生理盐水冲洗干净,置超净工作台无菌操作。角膜缘剪开去除角膜、虹膜,将晶状体前囊膜连同赤道部囊膜撕下，Hank液冲洗,剪成1mm×1mm小块，上皮面向下置25mL组织培养瓶内贴壁培养。把培养瓶轻轻翻转，加入适量的加入含15%胎牛血清的DNEM营养液，囊膜片在瓶内的上面而培养液在下面。置于37℃、5%CO2、95%空气、100%湿度的CO2培养箱中孵育4-6h左右，待囊膜片贴壁后再将培养瓶调回原位，此时培养液覆盖囊膜片而不使囊膜片漂浮，每周换液2次。晶体上皮细胞在接种3天后，在倒置显微镜下可见，植块边缘有新生的细胞爬出，细胞呈规则六边形，大小均匀，胞质透明。一周后可融合成小片细胞。二周后可长满融合成单层细胞。细胞多为类圆形、多角形。
2、传代培养：细胞铺满瓶底或生长到一定密度时，用0.25%胰蛋白酶消化，1∶2传代培养。传代时在培养瓶或培养皿底放置适当大小的盖玻片，细胞生长其上，便于光镜及免疫组化观察。细胞一般24h内贴壁，约3～4d细胞可达融合，融合的细胞和原代相似，大小基本一致。传代超过4～6代时，细胞的增长显著下降，转变成成纤维细胞形、三角形和长形。
3、个人体会：晶状体上皮细胞位于晶状体前囊膜及赤道部囊膜下，单层排列，没有其他细胞成分，是绝对的单一细胞培养。但细胞数量少较难贴壁。所以采用先置于培养瓶待其贴壁后翻转浸入培养液。另外要注意将囊膜剪小，上皮面向下，操作时有点难度的。培养基没什么特别的，用小牛血清也可以，但生长较慢。一般把多个囊膜置于同一培养瓶加大组织密度，效果较好。
