家兔椎间盘(intervertebral disc )细胞的体外培养方法
Material and method：
Material :
1. 培养皿、培养瓶、烧瓶、试管等。
2. 分离组织需要的眼科剪子、眼科镊子。
3. 5%CO2孵箱、PH计、95%氧气源。
4. 36电动恒温水浴。
5. 培养液、各种缓冲液及添加剂DMEM高糖培养基、Hank’s缓冲液 、20%胎牛血清，转换生长因子（TGF-β1）(5ng/mL)、胰岛素-转铁蛋白-硒（10ug/mL胰岛素，5ug/mL转铁蛋白，和0.5ng/mL亚硒酸盐）青霉素100U/Ml，链霉素100U/ml 。
6. 消化液 胶原酶(collagenase) 200U/ml 0.4%台盼兰、0.25胰蛋白酶
Method 1 组织块法
1. 取材：空气栓塞法处死家兔后，在无菌状态下获取家兔椎间盘组织。置于准备好的DMEM培养基（含双抗）。迅速带回到无菌超净台上。（注意事项：椎间盘位于相邻两个椎体之间，取材过程较为繁琐，要求动作迅速，争取在家兔死后半小时内完成，否则，该组织对缺氧耐受性差导致培养失败）。
2. 剪切：在超净台上，进一步将周围组织分离，用Hank’s液冲洗数遍，直到冲洗液透明为止。眼科剪刀将组织修剪为1~2cm3大小的小组织块，Hank’s冲洗干净。 加入少量含血清的培养液。(组织块不宜过小，否则不容易爬出足够数量的细胞)
3. 接种：用吸管吸取小组织块入培养瓶底部，摆放均匀，一个25cm2的培养瓶可放置10-15个小组织块，翻转培养瓶，加入少量培养液。4~6小时后，待组织块充分贴壁后，再翻转回来（动作一定要轻巧，以免刚刚贴壁的组织块脱离瓶底）
4. 置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液。待细胞95%融合时，0.25%胰蛋白酶传代分瓶。
Method 2 消化法
前面步骤同组织块法1，2。
3.组织块再进一步剪切，此时培养液中最好不加血清。完毕后，加入消化液，移入到10ml 离心管，培养箱内消化。每隔20分钟，用吸管吹打一次，观察液体有否变浑浊，并取少量液体，在相差倒置显微镜下观察。0.4%台盼兰染色计算活细胞数目。接种密度在105数量级。置于5%CO2孵箱中培养，每隔3天换液。待细胞95%融合时，0.25%胰蛋白酶传代分瓶。
鸭胚成纤维细胞原代培养
1．材料
1.1 10-12日龄非免疫受精鸭胚 购于雅安偏远山区
1.2标准胎牛血清(FBS) Tianjin.h&y bio.co;ltd
1.3MEM营养液（细胞增殖液；细胞维持液；洗液） GIBCO Invitrogen Corporation
1.410倍胰酶 （自配）
1.5抗生素 医用80万单位青霉素和医用100万单位链霉素
1.6灭菌的无钙、镁平衡盐溶液（自配）
2．实验器材与仪器
2.1实验器材
国产玻璃螺旋口细胞培养瓶（100ml）；培养皿；离心管（10ml）移液管（10ml与1ml）；漏斗；10层纱布；三角锥瓶（100ml）；吸耳；酒精灯；酒精（75%）；碘酒(3%)；火柴；瓶塞；镊子；滤器及配套滤膜（25mm直径 孔径0.22um）；50ml注射器；烧杯；蛋座；记号笔；离心管架；金属饭盒；照蛋器。
2.2 实验仪器
仪器名称 产地
超纯水仪 Water pro ps.labconco
电子天平 ShangpingFA2004. 上海天平仪器厂
高压灭菌仪 HIRAYAMA4
双蒸水仪 上海亚荣生化仪器厂
Orion台式PH测试仪 868型 OrionResearch.Inc
倒置显微镜 OLYMPUS
细胞培养箱 Queue
台式高速低温离心机 Beckman coultertm
超净台 苏州安泰空气技术有限公司
水浴锅 国华电器有限公司
低温冰箱 海尔集团
电热恒温鼓风干燥箱 DHG-9140型上海精宏实验设备有限公司
3.4 原代鸭胚成纤维细胞的制备。（10×ATV消化法）
实验前，无菌室用紫外线照射30min以上；超净台使用前应彻底擦干再用0.1%苯扎溴铵（新洁尔灭）擦拭一遍 。双手和瓶子表面用75%的酒精消毒。(以下步骤参考文献[2][4][5][6]进行的)
①取10-12日龄发育良好的鸭胚，气室向上置于蛋盘内，用碘酒擦拭鸭蛋表面，后用酒精脱碘，并在气室端打一小孔，沿气室用镊子小心剪去蛋壳露出气囊，以镊子去除覆盖于绒毛尿囊摸上的白膜，暴露出尿囊膜及附着的血管。用镊子撕开尿囊膜，夹住鸭胚颈部，移置于一小培养皿中。
②去除胚的头，四肢和内脏，用基础营养液清洗2-3次，直至组织出现透明，倒尽清洗液。
③用眼科剪剪碎胚体直至0.1-0.5立方毫米 。剪越碎越好。
④移组织碎块于三角锥瓶内，加0.2ml/胚 的10×ATV 37℃水浴锅内温 热消化 2min，后用吸管移至离心管中,用离心机5000rpm 离心5min弃上清液。
⑤加入含双抗的10%血清的基础营养液，移离心管下层组织碎块于三角锥瓶内，由于分散的细胞在没有胰蛋白酶的作用下，会很快聚合成小团，为减少细胞成团应不断吹打，直至成细胞全部分散开。
⑥取灭菌纱布叠成8-10层置于漏斗上并使中部略凹陷，以含双抗的10%的基础营养液润湿纱布，将已吹散的细胞悬液经纱布过滤除杂。
⑦过滤后的细胞悬液补加含有双抗的10%血清的基础营养液，按10ml装入细胞培养瓶（容量为150ml的细胞瓶），将细胞瓶置于37℃细胞培养箱内静置培养 。2小时后观察细胞贴壁情况，24小时后确认无污染。一般情况，24小时后细胞可基本长成单层。
猪甲状腺细胞原代培养方法
1.材料
猪甲状腺由锦州市屠宰场提供。F-12培养基（sigma公司）；胎牛血清（天津血液研究所）；胰蛋白酶（sigma公司）；胶原酶Ⅳ（sigma公司）；牛TSH（sigma公司）
2.方法
杀猪后迅速取出甲状腺1～2个，置于盛有75％酒精的烧杯中，用冰盒送至实验室（1小时以内）。立即置于pH为7.4的PBS缓冲液（含青链霉素）中，反复漂洗，直至漂洗液清澈透明。去除包膜及结缔组织，用眼科剪子、镊子将甲状腺组织剪成1mm3大小的碎块。置含0.25％胰酶和300U/ml胶原酶的容器中，放于37℃温箱中消化60min，每隔15min需摇动一次。用吸管将上清液的三分之二吸入离心管中，并加入含有胎牛血清的培养基终止消化。以1000转／分钟离心10分钟后，弃上清。将细胞沉淀用F-12培养基制成细胞悬液，充分吹打并用不锈钢网（200目）过目，再1000转／分离心10分钟，弃上清。沉淀悬于含15％胎牛血清和１U/L牛TSH的F-12培养基中，台盼蓝染色证明活细胞数大于95%，调整细胞浓度接种于培养板中（１ml／孔）。置于37℃的5%CO2 孵箱中，每二至三天换一次液，至细胞融合成片后用于实验。
3.结果
猪甲状腺细胞培养24小时，镜下细胞贴壁，呈聚集生长，细胞呈圆形或椭圆形。
4.讨论
胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织如上皮组织、肝、肾等，对传代细胞也非常好。但消化纤维性组织或较硬的癌组织则效果较差。胶原酶对胶原有很强的消化作用，适于消化纤维性组织、上皮组织以及癌组织等。由于甲状腺富含纤维性组织，所以甲状腺的消化分离一般采用胶原酶与胰蛋白酶联合消化法，用单一的胰蛋白酶消化效果一般；促甲状腺激素（TSH）是培养甲状腺细胞必备的，它能够起到促进甲状腺细胞生长的作用。本人也曾尝试过不加TSH，与加TSH对比明显可见细胞增长较慢，且形态不好。
细胞原代培养
材料：小鼠
器具：饭盒、纱布、小剪子、小镊子、大镊子、大烧杯、平皿、研磨玻片、滤网、离心管（15/50ml）、6孔培养板、吸管、移液管、手套、微量加样器
试剂：DMEM（含血清）、无血清DMEM培养基、胶原酶、PBS
准备：酒精擦拭台面后把物品摆放好，开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束。
操作步骤：
1、将小鼠断颈致死，置75%酒精泡2-3秒钟，取心脏、肝脏、脾脏、肾脏、肺脏、睾丸或卵巢，置于盛有PBS的平皿中。
2、剔除脂肪、结缔组织、血液等杂物，转移到另一个盛有PBS液的平皿中。
3、用手术剪将脏器剪成小块（1mm2），玻片研磨，转到离心管，离心1000rpm，5min。
4、视组织或细胞量加入5-6倍（3-5ml）胶原酶，37℃中消化20分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3-5ml含血清的培养液以终止胰酶消化作用。
6、用100目孔径滤网滤过，除去未消化的大组织块。
7、1000rpm，离心5分钟，弃上清液。
8、加入无血清培养液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入含血清的培养液1-2 ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至6孔培养板中，37℃下培养。
